Dexamethason a porušený transport nefrinu v důsledku stresu v endoplazmatickém retikulu

Japonští autoři se snaží svým článkem alespoň částečně objasnit možnost působení glukokortikoidů na nefrotický syndrom. Řadu let se ví, že cílovou buňkou jejich působení je pravděpodobně podocyt, který exprimuje jednak glukokortikoidní receptor (GR), ale i inaktivační enzymy (11β-hydroxysteroid dehydrogenáza typ II). Řada prací na molekulární úrovni prokázala, že různá hereditární onemocnění (včetně renálních) jsou způsobena poruchou transportu syntetizovaných bílkovin z endoplazmatického retikula (ER) na cílové místo určení (do organel, plazmatické membrány, extracelulárního prostoru). Transport z ER je negativně ovlivňován stresem ER. Ten může být vyvolán energetickou deplecí, hypoxií, virovou infekcí či jen špatným prostorovým uspořádáním syntetizovaných proteinů.

Ve shodě s těmito nálezy se ukázalo, že nefrin, hlavní komponenta „slit“ membrány podocytů, zůstává při získaném nefrotickém syndromu (NS) na podkladě minimálních změn glomerulů retinován intracelulárně v podocytu a nedochází k jeho expresi vně buňky a zabudování do membrány. Tím je tato membrána porušena a důsledkem je vznik nefrotického syndromu. Experimentálně byla tato situace navozena přidáním tunicamycinu.

Autoři využili předchozích zkušeností a zformovali hypotézu, že stres endoplazmatického retikula (navozený odebráním glukózy jako energetického substrátu pro tvorbu ATP), zodpovědný za patologickou N-glykosylaci nefrinu, může být pozitivně ovlivněn podáváním dexamethasonu.

Pro vlastní pokus byla vybrána subpopulace buněk HEK-293 (human embryonic kidney), která stabilně exprimovala na povrchu plnohodnotný nefrin (293-NPH). Jako indikátor stresu ER byl vytipován GRP 78 (glucose-regulated protein). Buňky 293-NPH byly vystaveny rozdílné koncentraci glukózy (5,5 a 25 mmol/l) a v různých časových intervalech (24, 48 a 72 hodin) byly vyhodnocovány koncentrace GRP78.

V kultuře 293-NPH buněk vystavených působení media s koncentrací glukózy 25 mmol/l byla po 72 hodinách detekována dostatečná koncentrace nefrinu, a to jeho obou izoforem (175-kDa – forma zůstávající v ER i 185-kDa – forma nefrinu zabudovaná v plazmatické membráně). Pokud se ale kultura vystavila koncentraci media 5,5 mmol/l glukózy, již po 24 hodinách nebylo možné detekovat aktivitu ani jedné izoformy nefrinu. Současně s tím byl zaznamenán signifikantní vzestup koncentrace GRP78. Po přidání tunicamycinu k oběma kulturám nebylo možné detekovat žádnou aktivitu normálně formovaného (glykosylovaného) nefrinu. Na základě těchto výsledků bylo uzavřeno, že snížená syntéza plně funkčního nefrinu je dána alterací jeho glykosylace v důsledku stresu ER.

K detekci lokalizace patologicky glykosylovaného nefrinu v buňkách bylo použito imunofluorescenční vyšetření za pomoci protilátek proti nefrinu a anti-KDEL (marker značící ER). Buněčné kultury kultivované v koncentraci glukózy 25 mmol/l vykazovaly jasnou lokalizaci nefrinu v plazmatické membráně, zatímco kultury kultivované v koncentraci glukózy 5 mmol/l měly většinu aktivity detekované intracelulárně, shodně s aktivitou ER. Hlavní komponentou, na kterou se patologicky glykosylovaný (ale i plně glykosylovaný) nefrin v ER váže, je zřejmě kalretikulin. Tato molekula je z velkou pravděpodobností i místem vazby nefrinu ve „slit“ membráně.

Po objasnění předchozích nálezů byl zkoumán vliv podání dexamethasonu (DEX) v různých koncentracích na stres endoplazmatického retikula a glykosylaci nefrinu. Ke kultuře 293-NPH buněk vystavených působení media s koncentrací glukózy 5,5 mmol/l byl přidáván dexamethason v koncentracích 0,01, 0,1 a 1,0 μmol/l . Koncentrace 1,0 a 0,1 μmol/l (nikoli však 0,01 μmol/l ) byly schopné významně zvýšit syntézu 185-kDa izoformy nefrinu, tedy plně glykosylované formy zabudované v plazmatické membráně, v porovnání s kontrolami bez dexamethasonu. Současně došlo u léčené skupiny k významnému snížení koncentrace GRP78. Účinek dexamethasonu se v kulturách dostavil v intervalu 48–72 hodin. Autoři také zkoumali přesné místo vazby/zásahu dexamethasonu v těchto buňkách za použití antagonisty GR RU486. Ukázalo se, že kultura „předléčená“ RU486 před aplikací dexamethasonu nebyla podáním kortikoidu vůbec ovlivněna, a koncentrace 185-kDa izoformy nefrinu se tedy nezvýšila. Toto zjištění vedlo autory k závěru, že dexamethason působí na podocyty (resp. 293-NPH buňky) prostřednictvím glukokortikoidních receptorů.

Pozitivní ovlivnění stresu endoplazmatického retikula prostřednictvím dexamethasonu je kromě snížení koncentrace GRP78 zřejmě dáno i úpravou energetických poměrů v buňkách, a sice zvýšením intracelulární koncentrace ATP, jež je zřejmě podmíněná up-regulací některých mitochondriálních genů. Pro plnou glykosylaci nefrinu je totiž potřebná dostatečná koncentrace nejen glukózy, ale i ATP jako energetického substrátu.

Na závěr si autoři ještě položili otázku, zda lze účinek dexamethasonu očekávat i u stresu endoplazmatického retikula vyvolaného jinou noxou než nízkou koncentrací glukózy. Jako odlišný podnět pro stres ER aplikovali A23187 (látku snižující intracelulární koncentraci Ca²⁺). Poté došlo k výraznému zvýšení koncentrace GRP78 (dokonce i za situace koncentrace glukózy v médiu 25 mmol/l ), tedy byl prokazatelně zvýšen stres ER. Podání dexamethasonu ale nevedlo ke zvýšení 185-kDa izoformy, pouze ke zvýšení syntézy 175-kDa izoformy nefrinu. Nefrin tedy zůstával lokalizován v ER a netransportoval se do plazmatické membrány. Zdá se tedy, že dexamethason ovlivňuje pouze ten stres ER, který závisí na intracelulární koncentraci glukózy a ATP.