Erytroferon – nový hormon regulující metabolismus železa

Tvorba funkčních erytrocytů vyžaduje dostatečnou dodávku železa erytroidním prekursorům. Nároky na dodávku železa výrazně stoupají po krvácení nebo při hemolýze a jsou zajištěny zvýšenou střevní absorpcí železa a zvýšeným uvolňováním železa ze zásob (Ganz et al., 2012).

Mechanismus, kterým se při zvýšené erytropoeze zvyšuje dostupnost železa, byl ale až dosud neznámý (Nicholas et al., 2002, Pak et al., 2006, Vokurka et al., 2006). Hlavním regulátorem střevní absorpce železa a jeho tkáňové distribuce je hormon hepcidin, který produkují játra. Hepcidin se váže na svůj receptor, feroportin, který umožňuje přesun železa z buněk do extracelulární tekutiny a vyvolává jeho endocytózu a degradaci. Tím blokuje střevní absorpci železa, uvolňování zásobního železa z jater a uvolňování železa z makrofágů. Tvorba hepcidinu je regulována sérovými koncentracemi železa, velikostí zásob železa a stoupá u stavů spojených se zánětem. Dlouho předpokládaná a hledaná regulační molekula, pravděpodobně produkovaná erytroidními prekursory v kostní dřeni, by měla umožnit při stimulaci erytropoezy zvýšit dostupnost železa a měla by tedy nejspíše inhibovat produkci hepcidinu. U myší bylo prokázáno, že krvácením nebo hemolýzou indukovaná anémie opravdu snižuje sérové hladiny hepcidinu a že tato inhibice závisí na produkci erytropoetinu a funkční kostní dřeni. U zdravých dobrovolníků snížilo podání erytropoetinu sérové hladiny hepcidinu, aniž by současně došlo ke změnám sérové koncentrace železa.

U stavů spojených s neefektivní erytropoezou, např. u talasémie, by zvýšené koncentrace uvedené regulační molekuly mohly supresí hepcidinu a neadekvátně zvýšenou střevní absorpcí železa způsobit přetížení organismu železem. V komentované práci spolupracovníci Tomase Ganze v Los Angeles a v New Yorku identifikovali nový hormon produkovaný erytroidními prekursory, který hraje klíčovou roli v časné supresi hladin hepcidinu po vyvolání stimulace erytropoezy krvácením či hemolýzou.

Autoři nejdříve studovali dynamiku odpovědi hepcidinu na zvýšenou erytropoetickou aktivitu. U flebotomovaných nebo erytropoetinem léčených C57/BL/6 myší začaly transkripce hepcidinu v játrech a sérové hladiny hepcidinu klesat nejpozději do devíti hodin po podnětu, dosáhly minima (10 % původních hodnot) po 15 hodinách a zůstaly alespoň mírně snížené až 48 hodin po podnětu. Časový vývoj sérových koncentrací hepcidinu u myší byl podobný vývoji sérových hodnot hepcidinu po podání erytropoetinu u zdravých dobrovolníků. Pokles hepcidinu nebyl v tomto experimentu provázen žádnou změnou sérových koncentrací železa. Regulace hepcidinu železem je zprostředkována transkripčními faktory BMP‑SMAD, jejich transkripce ale v tomto modelu hemoragií stimulované erytropoezy nebyla vůbec ovlivněna (snížena) a k supresi hepcidinu po flebotomii docházelo i u myší s vysokými hladinami hepcidinu v důsledku parenterálního podávání železa, které měly výrazně stimulovaný systém BMP‑SMAD. Bylo tedy jasné, že faktor(y) regulující koncentraci hepcidinu v souvislosti se stimulací erytropoezy jsou odlišné od faktorů souvisejících se změnami metabolismu železa.

Autoři poté studovali změny mRNA v kostní dřeni pomocí profilování genové exprese pomocí čipů Affymetrix, aniž by pozorovali jakékoli změny hladin mRNA faktorů Gdf15 a Twsg1, které byly dříve navrženy jako možné regulátory produkce hepcidinu kostní dření. Nejlepší časový vztah k supresi hepcidinu ukázala exprese do té doby necharakterizovaného transkriptu, označovaného v databázích jako Fam132b. Tento transkript kódoval secernovaný protein a jeho exprese byla výrazně indukována již čtyři hodiny po krvácení, ještě před supresí hepcidinu, a zůstávala zvýšená po celou dobu suprese jaterní produkce hepcidinu. Tento faktor byl pojmenován erytroferon (ERFE – erytroidní hormon ovlivňující metabolismus železa). Tento secernovaný protein byl také dříve popsán jako myonektin nebo CTRP15, člen rodiny proteinů příbuzných faktoru C1q komplementu a rodiny faktorů nekrotizujících tumory (TNF). Validační studie ukázala, že exprese erytroferonu stoupá v kostní dřeni nejpozději do čtyř hodin po flebotomii a dosahuje maxima (třicetinásobného vzestupu) do devíti hodin s dalším postupným poklesem během 24–48 hodin. Exprese erytroferonu stoupala paralelně se sérovými koncentracemi erytropoetinu. Podání erytropoetinu vyvolalo podobný, ale rychlejší vzestup exprese erytroferonu, což ukazovalo na možnost, že gen indukující erytroferon je regulován erytropoetinem. Exprese genu pro erytroferon nebyla regulována systémem BMP‑SMAD.

Studium tkáňové exprese genu pro erytroferon po podání erytropoetinu poté ukázalo, že gen pro erytroferon byl za bazálních podmínek slabě exprimován v tlustém střevě, duodenu, svalech, kostní dřeni a varlatech, po podání erytropoetinu ale stoupla exprese genu pro erytroferon jen v kostní dřeni a slezině (u myši patří i slezina mezi erytropoetické orgány). Pomocí průtokové cytometrie bylo možno ukázat, že gen pro erytroferon je exprimován různými erytroidními prekursory v průběhu jejich diferenciace, ale nejvyšší byla v bazofilních a polychromatofilních erytroblastech. Poté se autorům podařilo nejprve klonovat cDNA pro erytroferon a poté stanovit sekvenci aminokyselin lidského a myšího erytroferonu, které jsou ze 71 % identické (lidský erytroferon je tvořen 354 aminokyselinami a myší jen 340 aminokyselinami) s větší shodou v C‑terminální části, která obsahuje TNFα‑podobnou doménu. Aktivace genu pro erytropoetin je spojena s aktivací signální cesty JAK2‑STAT5. V regulační oblasti genu pro erytroferon nalezli autoři několik vazebných míst pro STAT5. Inhibitory STAT5 inhibovaly vzestup exprese erytroferonu po podání erytropoetinu. Exprese erytroferonu indukovaná erytropoetinem je tedy závislá na aktivaci systému JAK2‑STAT5. Naproti tomu exprese erytroferonu nezávisela na žádných faktorech indukovaných hypoxií nebo zánětem.

Myši s vyřazeným genem pro erytroferon nemají omezené dožití, jsou plodné a mají jen mírně sníženou koncentraci hemoglobinu v době růstu, ale nikoli v dospělosti, a vyznačovaly se dále jen statisticky nevýznamným trendem k menšímu objemu erytrocytů a nižším sérovým koncentracím železa. Od normálních myší se nelišily ani hladinou hepcidinu, ani množstvím železa ve slezině. Po flebotomii u myší s vyřazeným genem pro erytroferon nedocházelo k supresi hepcidinu a sérové koncentrace železa byly u flebotomovaných myší s vyřazeným genem pro erytroferon významně nižší než u normálních myší. Tyto nálezy potvrzují představu, že erytroferon je opravdu nezbytný k supresi hepcidinu při zvýšené erytropoetické aktivitě. Erytroferon ale na druhé straně nemá žádný vliv na diferenciaci erytroblastů. Absence erytroferonu u myší s vyřazeným genem pro erytroferon měla za následek zhoršenou mobilizaci železa po krvácení s následnou nižší koncentrací hemoglobinu, menším obsahem hemoglobinu v erytrocytech a nižším objemem erytrocytů a normalizace červeného krevního obrazu po flebotomii byla u těchto myší ve srovnání s normálním myším kmenem významně (o několik dní) opožděna.

Podání rekombinovaného erytroferonu snížilo expresi mRNA pro hepcidin v játrech a sérové hladiny hepcidinu. Rekombinovaný erytroferon měl tendenci k agregaci (podobně jako jiné proteiny ze superrodiny TNFα) a kromě suprese hepcidinu měl (snad v důsledku své agregace) i prozánětlivé účinky. Aby se vyloučil potenciální vliv agregace a prozánětlivý účinek agregovaného proteinu, byl lentivirový vektor kódující erytroferon přenesen do hepatocytů. Přestože byla takto navozená jaterní exprese mRNA pro erytroferon jen mírně zvýšena oproti bazálním hodnotám, došlo k významné supresi jaterní exprese mRNA pro hepcidin a poklesu sérových koncentrací hepcidinu, ale bez aktivace prozánětlivých mechanismů a také bez aktivace BMP/STAT (k té nedošlo ani po podání rekombinovaného erytroferonu). Erytroferon rovněž inhiboval produkci hepcidinu v kultivovaných hepatocytech in vitro.

Myši s talasémií měly anémii, inefektivní erytropoezu, splenomegalii a nízké koncentrace hepcidinu s následnou nepřiměřeně vysokou absorpcí železa a kumulací železa v játrech. Talasemické myši měli také vysoké sérové koncentrace erytropoetinu a zvýšenou expresi genu pro erytroferon v kostní dřeni. Erytroferon tedy zřejmě přispívá k supresi hepcidinu i v tomto myším modelu talasémie.