Embryonální kmenové buňky se množí a diferencují v ledvinách zbavených vlastních buněk – cesta k získání imunologicky shodných štěpů pro transplantaci ledviny?

Trvalý nedostatek kadaverózních štěpů a přetrvávající problémy s inkompatibilitou a infekčními riziky xenotransplantace vzbudily v poslední době velký zájem o možnost stimulace renálních kmenových buněk nebo podání kmenových buněk z kostní dřeně (eventuálně mesenchymálních kmenových buněk) nejen k dosažení lepší reparace poškozené ledviny, ale (nepochybně v podstatně delší časové perspektivě) i k potenciální regeneraci renálního parenchymu in vitro.

Studie s využitím kmenových buněk pro regeneraci ledvin jsou ale v samém počátku a stále není jasné, zda se kmenové buňky z kostní dřeně mohou diferencovat do různých typů renálních buněk (např. tubulárních buněk v modelech ischemické akutní tubulární nekrózy), nebo zda, jak ukazuje většina studií, tyto extrarenální kmenové buňky mají na reparaci ledvin jen relativně malý vliv a působí spíše uvolňováním solubilních faktorů, které mohou stimulovat proliferaci či diferenciaci renálních buněk (Romagnani a Kalluri, 2009). Větší pozornost je proto věnována identifikaci renálních kmenových buněk (Romagnani, 2009). Zatímco existence kmenových buněk v oblasti Bowmanova pouzdra, jež se zřejmě mohou diferencovat nejen do parietálních epitelií, a dokonce i podocytů, ale i buněk proximálního tubulu, se zdá být již poměrně dobře prokázána, přítomnost renálních kmenových buněk ve dřeni ledvin (se schopností proliferovat do tubulárních buněk distálního nefronu) se sice předpokládá, nebyla však dosud přesvědčivě dokumentována (Little a Bertram, 2009).

V komentované práci využili autoři poprvé zcela nový způsob možného ex vivo vytvoření „vlastních“ ledvin s využitím autologních kmenových buněk. Odebrané ledviny potkana byly postupně perfundovány neiontovými (Triton X‑100) a iontovými detergenty (kalcium chloridem a magnesium sulfátem – aktivují endogenní nukleázy s následným natrávením jaderného materiálu), hyperosmolárním roztokem chloridu sodného s cílem osmoticky rozrušit jaderné membrány, deionizovanou vodou s cílem dále osmoticky poškodit přítomné buňky a vypláchnout podané detergenty a deoxyribonukleázou (k enzymatické degradaci jaderného materiálu). Ke všem použitým roztokům byl použit azid sodný jako antimikrobiální agens. Tímto způsobem byly vytvořeny bezbuněčné houbovité kostry zachovávající při histologickém vyšetřením (vzhledem k nepoškozené extracelulární matrix a buněčným membránám) tvar původních ledvin a mikroskopicky struktury glomerulů i tubulů. Do této bezbuněčné ledvinové „kostry“ (lešení – „scaffold“) bylo poté intraarteriálně podáno 2 × 10⁶ myších embryonálních kmenových buněk. Jejich lokalizace v bezbuněčné ledvinové kostře byla kontrolována fluorescenčním mikroskopem (buňky byla značeny zeleným fluorescenčním proteinem) a celý tento preparát byl kultivován při teplotě 37 °C v mediu obsahujícím 5% CO₂ bez růstových faktorů a proces proliferace a diferenciace podaných kmenových buněk v acelulární ledvinové kostře byl v pravidelných intervalech sledován mikroskopicky. Kultivace delší než 48 hodin ale vyžadovala pro další kultivaci vytvoření tkáňových řezů. V další fázi experimentů byla ledvinová kostra po podání embryonálních kmenových buněk promývána automatickým perfuzním systémem s kolísajícím perfuzním tlakem a kontrolou teploty a obsahu krevních plynů. Získané tkáňové řezy pak byly vyšetřovány mikroskopicky se současným studiem proteinů aktivovaných při diferenciaci (Pax‑2 a Ksp‑cadherinu), epitelizaci (cytokeratinu) a proliferaci (Ki‑67).

Výše popsanou metodou se autorům podařilo opakovaně vytvořit acelulární ledviny (houbovité, komprimovatelné, ale opět se vracející do původního tvaru), které si ale zachovaly díky přítomnosti bazálních membrán a extracelulární matrix základní architekturu normálních ledvin, včetně acelulárních glomerulů, tubulů a vaskulárních struktur. Acelulární ledviny neobsahovaly ani buňky, ani jejich drť, naproti tomu v nich bylo možno imunohistochemicky prokázat v normální lokalizaci základní proteiny bazálních membrán kolagen IV a laminin. V původně acelulárních ledvinách zůstalo retinováno 95,1% intraarteriálně podaných embryonálních kmenových buněk (značených zeleným fluoresceinem), a to ve vaskulárních strukturách a glomerulech. Postupně bylo možno pozorovat migraci podaných buněk i do peritubulárních cévních sítí, lepší výsledek poskytovaly acelulární ledviny promývané automatickým perfuzním systémem. V tkáňových řezech bylo možno prokázat nejen migraci, ale i proliferaci injikovaných embryonálních kmenových buněk. Do deseti dnů vyplnilymigrující a proliferující embryonální kmenové buňky téměř kompletně glomeruly i peritubulární kapiláry, jejich dělení bylo možno prokázat barvením na proliferační marker Ki‑67.

Intraarteriálně podané kmenové buňky ale až na vzácné výjimky nepronikaly do tubulárních struktur. K buněčné repopulaci distálního nefronu (počínaje kortikálním sběrným kanálkem) bylo třeba podat embryonální kmenové buňky cestou ureteru. Podání embryonálních kmenových buněk do kalichů acelulární ledviny vedlo k jejich postupné migraci do sběrných kanálků. Na rozdíl od velmi efektivní retence po arteriálním podání se ale při intraureterálním podání udrželo v acelulární ledvině jen asi 50 % podaných buněk a migrace do sběrných kanálků byla poněkud nehomogenní, což ale (dle autorů) může být způsobeno odlišnostmi v papilární struktuře mezi hlodavci a vyššími savci, jako jsou prasata nebo člověk, kde by teoreticky intraureterální podání embryonálních buněk mohlo být z hlediska retence účinnější.

Embryonální kmenové buňky se ve vaskulárních strukturách diferencovaly do typických endotelových buněk a také do tubulárních struktur, v obou případech s apoptózou centrálně lokalizovaných buněk a vytvářením dutých vaskulárních a tubulárních struktur. Diferenciaci embryonálních buněk bylo možno prokázat i imunohistochemicky, např. objevením cytokeratinu v oblastech, kde docházelo k reepitelizaci, Pax‑2 v buňkách adherujících jak k tubulárním, tak vaskulárním bazálním membránám, nebo KsP‑cadherinu (markeru diferenciace buněk distálního nefronu) v tubulárních buňkách.