Xenotransplantace: nová éra transplantační medicíny právě začala

Pro mnoho nemocných žijících se selháním ledvin je provedení transplantace ledviny nedostižnou iluzí, a to i přes rozšíření indikací pro zemřelé i žijící dárce. Prase domácí je slibným zdrojem ledvinových xenograftů. Již byly provedeny tzv. proof of concept studie s xenotransplantacemi ledvin od prasete primátům kvůli podobnosti s biologií člověka. Tyto práce ukázaly, že hlavním problémem xenotransplantací je imunitní bariéra spočívající v přítomnosti sacharidových antigenů na endotelu cév, které jsou pro lidi a opičí primáty cizí. Genové modifikace, které odstranily tyto antigeny, zlepšily výsledky prasečích xenotransplantací u opičích primátů, protože se přestaly vyskytovat hyperakutní rejekce. Model byl dále zlepšen modifikací rizika cytotoxicity zprostředkované komplementem a snížením rizika cévní trombózy.

Navzdory úspěchům s těmito experimentálními modely není pravděpodobné, že poznatky, které z nich vycházejí, budou jednoduše přenositelné na člověka, protože existuje mnoho biologických rozdílů mezi primáty a lidmi, a to včetně humorální imunity. Je tak jasné, že jedině provedení xenotransplantací u lidí se stane základem budoucího poznání, podobně jako tomu bylo u prvních alotransplantací.

Program xenotransplantací byl v University of Alabama v Birminghamu zahájen v roce 2015 s cílem vytvořit robustní, udržitelný a etický model u člověka. V těsné blízkosti transplantačního centra proto byla pro chov zvířat postavena budova, jež splňuje nejpřísnější nároky na přítomnost jakýchkoliv patogenů a je určena výhradně pro xenotransplantace u lidí. Byl vytvořen multidisciplinární tým expertů znalých translačního výzkumu a konečně bylo vytvořeno strategické partnerství s komerčními subjekty a regulačními úřady, což jsou nezbytné předpoklady k zavedení xenotransplantací do klinické praxe.

Nejdříve bylo rozhodnuto o vytvoření preklinického modelu, který má řešit základní otázky týkající se bezpečnosti a proveditelnosti xenotransplantací od prasat lidem. To je nezbytným předpokladem zahájení budoucího klinického zkoušení, protože je nutné posoudit rizika hyperakutní rejekce, chirurgických komplikací a přenosu virů ještě před zahájením fáze I klinického zkoušení u lidí.

Autoři proto vytvořili preklinický model xenotransplantace ledvin u pacientů se smrtí mozku, kteří nebyli indikováni jako dárci orgánů. Nejdříve získali souhlas k tomuto experimentu od rodiny. Podmínkou transplantace byl negativní cross‑match s dárcovským prasetem. Xenogenní štěpy byly odebrány geneticky modifikovaným prasatům, která poskytla společnost Revivicor, Inc. Tato prasata mají ve svém genomu 10 genetických modifikací zahrnujících inzerci dvou lidských genů potlačujících aktivaci komplementu (hDAF a hCD46), dvou lidských genů podílejících se na antikoagulaci (hTBM a hEPCR), deleci (knock‑out) tří prasečích genů pro sacharidové antigeny a receptor pro prasečí růstový hormon. Tato prasata neexprimují žádné antigeny na erytrocytech, a jsou tak univerzálními dárci vzhledem ke krevním skupinám. Prasata nemají ve svém genomu prasečí cytomegalovirus a endogenní retrovirus C. Prasata jsou testována každé tři měsíce na přítomnost virů. Před transplantací byly provedeny křížové zkoušky pomocí průtokové cytometrie. Ledviny byly asepticky odebrány en bloc. Příjemcům byla provedena bilaterální nefrektomie otevřenou cestou k navození anurie. Před transplantací byly ledviny odděleny a byly provedeny preimplantační biopsie. V porovnání s lidskými ledvinami měly štěpy velmi jemné pouzdro a byly palpačně měkké. Uretery byly širší než u lidí. Proto byla chirurgická manipulace náročnější. Pravá a levá ledvina byla transplantována heterotopicky pomocí běžné techniky. Pravý ureter byl anastomozován do měchýře a levý ureter byl vyústěn urostomií. Postreperfuzní biopsie byla provedena jenom u levého xenograftu. Indukční imunosuprese sestávala ze sestupných dávek methylprednisolonu, antithymocytárního globulinu (ATG) v celkové dávce 6 mg/kg a aplikace anti‑CD20 monoklonální protilátky. Udržovací imunosuprese zahrnovala mykofenolát mofetil, takrolimus a prednison. Předtransplantační fáze trvala 19 hodin, transplantace 4 hodiny a potransplantační sledování (follow‑up) trvalo 74 hodin. Primárním cílem bylo ověření technické bezpečnosti a realizovatelnosti výkonu. Autoři nepředpokládali posouzení účinnosti vzhledem k přítomnosti smrti mozku příjemce a z toho vyplývajících hemodynamických a dalších změn, které mají závažné dopady na renální hemodynamiku.

Doba teplé ischemie byla 28 a 29 minut a doba studené ischemie byla 4 hodiny pro levý xenograft a 5 hodin a 37 minut pro pravý xenograft. Methylprednisolon a ATG byly podány před xenotransplantací. Obě ledviny byly dobře perfundovány a perfuze následně ověřena dopplerovskou sonografií. Příjemce byl po celou dobu operace oběhově stabilní, byl mu podáván fenylefrin a dopamin před reperfuzí a po reperfuzi. Pravá ledvina začala produkovat moč po 23 minutách, diuréza z levé ledviny byla pomalá. Ledviny byly observovány po dobu 60 minut, známky hyperakutní rejekce se neobjevily. Postreperfuzní biopsie prokázala střední tubulární poškození a normální glomeruly. Nebyly přítomny žádné známky poškození endotelu, fibrinových trombů ani pozitivita barvení IgG, IgM a C4d. Během třídenního sledování se u příjemce vyvinuly známky multiorgánového selhání, pancytopenie a diseminované intravaskulární koagulace (DIC). Pro acidózu byl podáván bikarbonát, kontinuálně heparin, krevní transfuze a vysoké dávky methylprednisolonu k překonání fyziologie mozkové smrti. Štěpy byly prohlédnuty první a třetí den a byly provedeny biopsie. Dopllerovsky byla potvrzena dobrá perfuze, měly normální turgor. Studie byla ukončena po 77 hodinách a 32 minutách po reperfuzi a 8 dní po prokázání mozkové smrti. Během pokusu nedošlo k poklesu koncentrace kreatininu v séru a žádná z ledvin nevylučovala signifikantní množství kreatininu. Sérové hodnoty elektrolytů byly po dobu experimentu normální. Biopsie první den prokázaly přítomnost trombotické mikroangiopatie s difuzní kongescí kapilár glomerulů a přítomností fibrinových trombů. Biopsie provedené třetí den prokázaly zhoršení tubulárního poškození s akutní tubulární nekrózou (ATN), další známky trombotické mikroangiopatie (TMA) jako mezangiolýza ale přítomny nebyly. Barvení C4d bylo negativní v obou biopsiích. Nebylo prokázáno přenesení prasečích endogenních retrovirů vyšetřením periferní krve a ani nebyl pozorován chimérismus, protože exprese prasečího ribozomálního proteinu u příjemce zůstala negativní. Tento experiment tak byl jednou z prvních xenotransplantací geneticky upravených prasečích ledvin člověku ve zvláštním preklinickém modelu příjemce se smrtí mozku.